Nascida Audrey Kathleen Ruston na capital belga, era a única filha de Joseph Anthony Ruston (um banqueiro anglo-irlandês) e Ella van Heemstra (uma baronesa holandesa descendente de reis ingleses e franceses). Seu pai anexou o sobrenome Hepburn, e Audrey se tornou Audrey Hepburn-Ruston. Ela tinha dois meio-irmãos, Alexander e Ian Quarles van Ufford, do primeiro casamento da sua mãe com um nobre holandês.
Audrey foi considerada, a príncípio, uma garota "alta, ossuda, de pés excessivamente grandes para se tornar uma estrela". Mas Audrey, mesmo vivendo na época em que as baixinhas, de curvas generosas, pés miúdos e olhos claros imperavam, soube usar os seus "defeitos" como seus dons e conquistar o mundo com seu lindo rosto, sua elegância e seus profundos olhos castanhos. Segundo o estilista Givenchy, que era incumbido de vestí-la, Audrey era um ideal de elegância e uma inspiração para o trabalho dele.
Audrey sempre será lembrada pelo filme Bonequinha de Luxo (Breakfast at Tiffany's, 1961) como Holly Golightly, uma prostituta de luxo que sonhava em se casar com um milionário, papel totalmente oposto ao com que ela foi premiada com o Oscar de 1954, em que vivia Ann, uma princesa que fugindo de seus deveres reais, se apaixona por um jornalista interpretado por Gregory Peck, em A princesa e o plebeu (Roman Holiday, 1953).
O ator Gregory Peck, par romântico de Audrey no filme A Princesa e o Plebeu (Roman Holiday, 1953), foi quem a apresentou ao ator Mel Ferrer, que, depois de participar de uma peça com Hepburn, pediu-a em casamento de. A atriz contracenou no filme Guerra e Paz (War and Peace, 1956) com o então marido Mel Ferrer. Os dois fizeram um casal, em que Audrey interpretava uma aristrocrata russa, que se apaixona pelo princípe da Rússia André (Mel Ferrer).
Depois de nascimento dos filhos, ela abandonou a carreira no cinema. Ao final de sua vida, nomeada embaixadora da UNICEF, trabalhou incansavelmente como voluntária para causas infantis. Hepburn falava francês, italiano, inglês, holandês e espanhol. Havia dúvidas se ela falava espanhol ou não, mas recém descobertas imagens da UNICEF mostram-na falando a língua fluentemente no México. No filme Bonequinha de Luxo, ela é mostrada tentando aprender português, e reclama do grande número de verbos irregulares.
De acordo com seu filho Sean Ferrer, os filmes favoritos dos quais estrelou foram Uma cruz à beira do abismo (por sua mensagem social) e Cinderela em Paris (por ter se divertido muito nas filmagens deste). No entanto, ela havia declarado numa entrevista à Barbara Walters que A princesa e o plebeu era o filme mais querido dela.
Além de um rosto bonito, Audrey era uma mulher humilde, gentil e charmosa, que preferia cuidar dos outros a seu redor do que de si mesma. É considerada a eterna "bonequinha de luxo". Faleceu aos 64 anos, de câncer no útero.
